| | | 單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)技術(shù)，其原理是對(duì)分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進(jìn)行高通量測(cè)序，廣泛應(yīng)用于癌癥研究、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細(xì)胞分化、免疫機(jī)制、微生物等方向的研究。
獲得高覆蓋度高保真性的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物是準(zhǔn)確全面的測(cè)序結(jié)果的保障。為了保證基因組高覆蓋度無(wú)偏好性的擴(kuò)增，在單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)誕生的近二十年時(shí)間里，全基因組擴(kuò)增技術(shù)經(jīng)歷了幾次重大的變革，WGA主要有三種方式：DOP-PCR，MDA，MALBAC。下面小編就來(lái)為大家介紹一下WGA技術(shù)的演變歷程，以及怎樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的擴(kuò)增方式。 |
 | DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction) |  |
技術(shù)原理：簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR，引物的3' 含6bp的隨機(jī)序列，可以隨機(jī)的和基因組DNA結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)全基因組的擴(kuò)增[1]。 應(yīng)用范圍：因?yàn)镻CR的指數(shù)擴(kuò)增特性，放大了基因組上不同序列之間的差異，因而導(dǎo)致擴(kuò)增出的基因組覆蓋度較低。盡管如此，在1M bin size的水平上，DOP-PCR適合對(duì)染色體的CNV進(jìn)行定量。
商品化試劑盒：Sigma-Aldrich, GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit。 
圖1 DOP-PCR技術(shù)原理[4]
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| MDA (Multiple Displacement Amplification) | |
技術(shù)原理：2001年由Laskin團(tuán)隊(duì)發(fā)明，使用隨機(jī)的六聚體引物和φ29DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，該聚合酶具有很強(qiáng)的鏈置換特性，能夠在等溫的條件下，擴(kuò)增產(chǎn)生50~100kb的核酸片段。同時(shí)由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對(duì)活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的復(fù)制保真性[2]。
應(yīng)用范圍：MDA法比DOP-PCR擁有更高的基因組覆蓋度，φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性，使得MDA法在對(duì)SNV的分析，以及構(gòu)建大片段文庫(kù)上有著顯著優(yōu)勢(shì)。但是，和DOP-PCR相同，MDA法依然是指數(shù)擴(kuò)增，因此依然存在PCR反應(yīng)的序列偏好性，然而，和DOP-PCR不同的是，這種偏好性并不能重復(fù)，因此MDA法不適合進(jìn)行CNV的分析。 商品化試劑盒：Qiagen, REPLI-g Single Cell Kit。 
圖2 MDA技術(shù)原理[4]
| MALBAC (Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles) | |
技術(shù)原理：2012年由謝曉亮團(tuán)隊(duì)發(fā)明，擬線性的擴(kuò)增過(guò)程降低了指數(shù)擴(kuò)增的序列偏好性。擴(kuò)增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的隨機(jī)序列，可以和模板在15~20℃的低溫下結(jié)合，經(jīng)過(guò)8~12個(gè)循環(huán)的擬線性擴(kuò)增后，再對(duì)這些環(huán)狀的擴(kuò)增子進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增[3]。
應(yīng)用范圍：MALBAC法的優(yōu)勢(shì)在于，雖然它依然存在一定的序列偏好性，但和MDA不同，MALBAC的這種偏好性在不同的細(xì)胞之間是可重復(fù)的，因此可以通過(guò)對(duì)參考細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行CNV的分析；另外，由于其擴(kuò)增的均一性，MALBAC法擴(kuò)增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱點(diǎn)在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此MALBAC在檢測(cè)SNV時(shí)將會(huì)出現(xiàn)更多的假陽(yáng)性；另外，由于它可重復(fù)性的序列偏好性，基因組上低擴(kuò)增的區(qū)域有時(shí)會(huì)在擴(kuò)增過(guò)程中丟失。 商品化試劑盒：Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit. 
圖3 MALBAC技術(shù)原理[4]
由上述的分析可見(jiàn)，MDA和MALBAC各有優(yōu)劣，實(shí)際上在不同的文獻(xiàn)中，研究者也會(huì)根據(jù)研究目的的不同，采取不同的方式對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，以滿足研究的需要[5-7] | picoplex特殊隨機(jī)引物起始的熱循環(huán)擴(kuò)增 | |
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 picoplex技術(shù)相比于以往的PCR、MDA、MALBAC為基礎(chǔ)的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，擴(kuò)增重復(fù)性良好。特別設(shè)計(jì)的隨機(jī)引物（參加US patent 8，206，913）能減少引物二聚體的形成，從而提高引物和模板的配對(duì)效率。 
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[7] Gawad C, Koh W, Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the scienc.[J]. Nature Reviews Genetics, 2016.
華雅思創(chuàng)Rubicon授權(quán)代理，正品現(xiàn)貨，產(chǎn)品信息如下： PicoPLEX® WGA Kit：用于單細(xì)胞文庫(kù)構(gòu)建的全基因組擴(kuò)增解決方案 PicoPLEX® DNA-seq Kit：單細(xì)胞 DNA 文庫(kù)制備技術(shù)，適用于 Illumina 所有 NGS 測(cè)序平臺(tái) ThurPLEX® DNA-seq Kit：更高的通量, 更好的性能, 用于所有 Illumina 的 NGS 平臺(tái) 品牌/生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品名稱(chēng) 單位
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